参考情報

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図1

11 .

ペプチドマップ法における分析手順と目標性能パラメーターの確定

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ペプチドマップ法は相対比較の手法であるため，試料タンパ

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原薬，製剤又は標準品／標準物質を分析する際，分析の妨害

90

ク質に対して行われるいかなる精製や前処理ステップも，標準

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となる添加剤やキャリアタンパク質を含む場合は分離・精製が

91

品／標準物質に対しても同様に実施する必要がある．残存する

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必要なことがある．残存する妨害物質は，酵素的切断の効率や

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物質，精製手順，又はタンパク質の前処理が分析法の特異性及

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ペプチドマップの見た目に影響を与える場合がある．残存する

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び精度に及ぼす影響は，開発段階で精査し，分析法バリデーシ

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物質や試料精製過程が最終的なペプチドマップに及ぼす影響は，

94

ョンにおいて実施される頑健性の検討に組み入れることを考慮

70

開発過程において評価する必要がある．

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すべきである．
4.

3.

前処理

71

タンパク質の三次構造により，切断酵素が全ての切断部位に

96

72

完全に作用するのを妨げられることにより，配列カバー率が不

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切断技術の選択は，タンパク質により異なる．酵素的及び化

消化

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十分となることがある．タンパク質のカオトロピック試薬

98

学的手法において汎用される切断試薬とその特異性を表１に示

74

(例：塩化グアニジニウム，尿素)及び界面活性剤(例：ドデシル

99

す．必要な場合には，他の切断試薬を使用することや方法を組

75

硫酸ナトリウム)による処理は消化前にタンパク質の折りたた

100

み合わせることもある．

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みをほどくために使用される．変性試薬は酵素活性に影響を及

101

77

ぼしうるため，追加の精製(例：透析ろ過)や希釈操作が消化前

種類

試薬

特異性

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に必要になる場合がある．酵素が切断部位に完全に作用できる

酵素的

トリプシン(EC 3.4.21.4)

アルギニン及びリシ

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ように，消化前にジスルフィド結合の還元及びアルキル化が必

手法

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要なこともある．しかし，システイン－システイン結合の情報

キ モ ト リ プ シ ン (EC

疎水性アミノ酸残基

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はその際に失われてしまう．ジスルフィド結合の還元に一般的

3.4.21.1)

(例：ロイシン，メチ

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に使用される試薬には，ジチオスレイトール及びトリス(2－カ

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ルボキシエチル)ホスフィンのようなトリアルキルホスフィン

芳香族アミノ酸)のC

84

化合物がある．還元されたシステインをアルキル化する試薬に

末端側

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は，ヨードアセトアミド，ヨード酢酸及び4－ビニルピリジン

ペプシンA (ペプシン)

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がある．アルキル化試薬の使用によりペプチドへの付加体が生

(EC 3.4.23.1)

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じる可能性があり，影響を受けたペプチドはクロマトグラフィ

リシルエンドペプチダー

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ーの分離に影響を与え，分子量が変化する．

表1

切断試薬の例

ン残基のC末端側

オニン，アラニン，

特異性の低い消化
リシン残基のC末端側